Изучение комплекса антибиотиков феназинового ряда от культуры синегнойной палочки

Пальчевская Екатерина Сергеевна

Национальный исследовательский Томский политехнический университет

Аннотация

         Феназины представляют собой группу гетероциклических азотсодержащих соединений, показывающих широкий спектр антибиотических свойств. Феназины интенсивно изучаются для их дальнейшего применения в лечении болезней растений. Синегнойная палочка продуцирует два феназиновых соединения как вторичные метаболиты. Эти метаболиты идентифицированы как феназин-1-карбоновая кислота (PCA) и 2-гидроксифеназин (2-ОН Р). В данной работе выделение и изучение комплекса феназинов было сделано с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ), колоночной хроматографии, УФ-спектрофотометрии и спектроскопии ядерного магнитного резонанса. Было изучено влияние различных минеральных солей на продукцию феназинов.

Abstract

      Phenazines represent a group of heterocyclic nitrogen-containing compounds showing a broad spectrum of antibiotic properties. Phenazines are studied extensively for their further application in plant disease management. Pseudomonas aeruginosa produce two phenazine compounds as the secondary metabolites. These metabolites are known as phenazine-1-carboxylic acid (PCA) and 2-hydroxyphenazine (2-OH P). In this study separation and characterization of phenazines were done by using thin layer chromatography (TLC), column chromatography and ultraviolet (UV) spectrum and nuclear magnetic resonance spectroscopy. The effect of various mineral salts on production of phenazine was studied.

Ключевые слова: феназины, синегнойная палочка, выделение, идентификация

Keywords: Pesudomonas aeruginosa, phenazines, isolation, identification.

Введение

         В настоящее время актуальной проблемой растениеводства является борьба с заболеваниями сельскохозяйственных культур, возбудителями которых являются различные фитопатогенные грибы и бактерии. Используемые методы химической защиты имеют ряд существенных недостатков, поскольку их применение приводит к загрязнению окружающей среды, накоплению токсичных соединений в продуктах питания, что, несомненно, сказывается на здоровье людей и животных. Использование естественных обитателей почвы в качестве основных биоконтролирующих агентов позволяет устранить данные недостатки, а также способствует ее оздоровлению. В связи с этим актуальным является использование наиболее активных штаммов микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности для борьбы с фитопатогенами, так как они эффективны в очень малых концентрациях, и для защиты растений требуется небольшое количество действующего вещества.

         Особое место среди естественных антагонистов, обладающих комплексной биоактивностью (фунгицидной, бактерицидной) принадлежит ризобактериям, которые также оказывают положительное влияние на рост растений. Они известны как содействующие росту растений ризобактерии (plant growth promoting rhizobacteria - PGPR).Они принадлежат к PGPR из-за способности колонизировать корни растений и стимулировать их рост за счет уменьшения частоты заболеваний. Подавление заболеваний включает в себя ингибирование патогенов конкуренцией и/или путем антагонизма [1-2].

         Наиболее перспективными и хорошо изученными естественными антагонистами фитопатогенных грибов и бактерий считаются бактерии рода Pseudomonas, синтезирующие антибиотики ароматической природы, подавляющие развитие фитопатогенов [3].

Целью данной работы является оптимизация условий культивирования бактерий P.aeruginosa для повышения выхода антибиотиков феназинового ряда.

В задачи работы входит:

1. Выделение комплекса феназинов, выделяемого бактериями  P. aeruginosа, штамм 67.

2. Анализ качественного и количественного состава выделенных феназинов.

3. Изучение влияния условий культивирования на выход комплекса феназинов.

4. Выявление кофакторов и ингибиторов биосинтеза феназинов

            Pseudomonas aeruginosa (P. аeruginosа, синегнойная палочка) - классический представитель рода Pseudomonas. Различные штаммы этих бактерий широко распространены в природе. В состав синтезируемых окрашенных соединений различных типов, хорошо проникающих в субстрат, входят соединения феназинового и пиридинового ряда. P. aeruginosа может одновременно образовывать комплекс до 6 пигментов феназинового ряда, качественный и количественный состав которых зависит от компонентов среды, условий культивирования, индивидуальных особенностей бактериальных штаммов и источников выделения [4]. По сравнению с типичными антифунгальными препаратами, феназины имеют более широкий спектр действия. Они препятствуют развитию не только фитопатогенных грибов, таких как Monilinia fructigena, Rhizoctonia solani, Alternaria solani, Septoria tritici,  Fusarium oxysporum, Pythium myriotylum, Candida albicans и других, но и целого ряда фитопатогенных бактерий – Acidovorax avenae, Erwinia carotovora, Pseudomonas syringae, Xanthomonas campestris. Кроме того соединения феназинового ряда улучшают способность растений усваивать минеральные вещества из почвы [5-6].

         Антибиотики феназинового ряда – большая группа низкомолекулярных гете­роциклических азотсодержащих соединений, синтезируемых в ходе реакций ароматического пути, которые различаются по своим химиче­ским и физическим свойствам в зависимости от типа и расположения функциональных групп [7].    Бактерии являются единственным известным источником природного феназина.

         В качестве заместителей в состав молекулы феназина могут входить различные функциональные группы. Наиболее распространенные производные феназина приведены на Рисунке 1:

Рисунок 1 – Строение феназиновых антибиотиков

R1,R2,R3 = 0 – феназин; R1:COOH– феназин-1-карбооновая кислота; OH– 1-оксифеназин (гемипиоцианин); CONH2– феназин -1-карбоксамид (PCN ) (оксихлрорафин); R1 = О-, R2 = СH3 – пиоцианин.

R1 = COOH, R3 = OH – 2-оксифеназин-1-карбоновая кислота; R1 = COOH, R2 = CH3 – 5-метилфеназин-1-карбоксилат [8].

Материалы и методы

         Объект исследования

         В работе использовался штамм Pseudomonas aeruginosa, из коллекции лаборатории микробиологии Областной клинической больницы P. aeruginosа, штамм 67.

         Среды

         Для культивирования P. aeruginosа, штамм 67 были использованы четыре среды различного состава: среда для культивирования гетеротрофных микроорганизмов  РСА (Plate Сount Аgar), синтетическая  минимальная среда М-9 (Маниатис и др.), среда Кинг В, применяемая для культивирования бактерий рода Pseudomonas, универсальная питательная среда ГРМ-бульон [9].

Таблица 1 - Составы сред для культивирования P. aeruginosа, штамм 67

         Получение культуральной жидкости штаммов P. aeruginosа

         Получение биомассы микроорганизмов осуществляли путём периодического культивирования P. aeruginosа, штамм 67 без аэрации в темноте в колбах Эрленмейера объемом 50 мл при температуре 24 ˚С на четырех средах различного состава. Время культивирования - 3, 5 и 7 суток.

         Выделение феназинов из культуральной жидкости

         Экстракцию феназинов проводили на 3-и, 5-е и 7-е сутки культивирования по методике, за основу которой была взята экстракция производных феназина, предложенная M.E.Levitch и E.R.Stadtman [10].

         Продуценты феназинов выделяют свои антибиотики в окружающую среду, то есть в культуральную жидкость. Поэтому на первом этапе выделения феназинов отделяли биомассу клеток фильтрованием. Затем фильтрат  подкисляли 2 н соляной кислотой до рН 1-2 и проводили двукратную экстракцию добавляя равный объем этилацетата. Экстракты обезвоживали с помощью сернокислого натрия.

         Анализ экстрактов феназинов

         Разделение и очистка феназиновых соединений осуществлялась методами тонкослойной и колоночной хроматографии. В качестве подвижной фазы использовали систему растворителей гексан - этилацетат (3:2).

         Элюаты анализировали на наличие феназинов при помощи УФ-спектрофотометрии, сканируя в диапазоне волн 190-600 нм. На основе данных оптической плотности и молярных коэффициентов поглощения рассчитали концентрации полученных веществ, используя закон Бера-Бугера-Ламберта. Также структуры полученных веществ определяли измерением температур плавления и при помощи спектроскопии ядерного магнитного резонанса.

Результаты

         При культивировании P.aeruginosa, штамм 67 на всех средах наблюдалось образование бело-серебристой пленки на поверхности среды. С увеличением времени культивирования толщина пленки увеличивалась, что говорит о росте биомассы.

         Экстракты, полученные от P. аeruginosa, штамм 67 имели желтое окрашивание, характерное для феназинов, интенсивность которого нарастала с увеличением времени культивирования микроорганизмов.

          В ходе работы было установлено, что при экстракции феназинов из всех четырех сред на 3-й день культивирования в культуральной жидкости находится только одно вещество (феназин-1-карбоновая кислота (РСА)), на 5-й и 7-й дни обнаружены два вещества (феназин-1-карбоновая кислота и 2-гидроксифеназин (2-ОН-Р)).

Рисунок  2 -  Концентрация феназин-1-карбоновой кислоты в различных средах  на 3-й день культивирования

Рисунок  3 - Концентрация феназинов в различных средах на 5-й день культивирования

Рисунок 4 -  Концентрация феназинов в разных средах на 7-й день культивирования

         Поскольку концентрация феназинов на 7-й день культивирования незначительно больше, чем на 5-й день, оптимальным временем культивирования можно считать 5 суток.

         Из полученных данных видно, что концентрация феназинов, выделенных из среды Кинг В гораздо больше, чем из остальных сред. Поэтому среда Кинг В была выбрана базой для создания модифицированной среды, при культивировании на которой P. aeruginosa, штамм 67 можно получить максимальный выход антибиотиков феназинового ряда.

         Среда Кинг В была модифицирована с использованием добавок минеральных солей различных концентраций. Полученные среды условно назвали KB I, KB II, KB III, KB IV, KB V, KB VI. Схема модификации среды показана на Рисунке 5. Все соли вносились в среду в концентрациях 1,5 г/л, 0,75 г/л, 0,375 г/л, 0,187 г/л, 0,094 г/л, 0,047 г/л.        

Рисунок 5. Модификация среды Кинг В

         Получение культуральной жидкости микроорганизмов осуществляли путём периодического культивирования без аэрации в темноте в колбах Эрленмейера объемом 50 мл при температуре 24 ˚С. Время культивирования 5 суток. Экстракцию феназинов проводили на 5-е сутки культивирования по методике, описанной ранее.

         При добавлении всех минеральных солей в Кинг В в концентрациях 1,5 г/л, 0,75 г/л, 0, 375 г/л, 0,187 г/л роста микроорганизмов не наблюдалось, следовательно, данные концентрации солей являются губительными для синегнойной палочки. При добавлении солей в концентрации 0,094 г/л во всех модифицированных средах фиксируется повышение продукции феназинов по сравнению со средой Кинг В. Максимальное количество продуцируемых феназинов наблюдалось при концентрации солей в среде 0,047 г/л. Изучение продукции феназинов при меньших концентрациях солей будет проводиться в дальнейшем.

         Далее приведены диаграммы зависимости продукции антибиотиков феназиного ряда от типа и концентрации минеральных солей  в среде. Прим.: 2-ОН-Р - 2-гидроксифеназин, РСА - феназин-1-карбоновая кислота.

Рисунок 6. Влияние солей на продукцию 2-гидроксифеназина

Рисунок 7. Влияние солей на продукцию феназин-1-карбоновой кислоты

         На Рисунке 6 видно, что при добавлении в среду солей CuCl₂·2H₂O и ZnSO₄·7H₂O продукция 2-гидроксифеназина отсутствует. Из чего можно сделать вывод, что ионы меди и цинка являются ингибиторами биосинтеза 2-гидроксифеназина, в то же время NH₄NO₃ является кофактором данного процесса и позволяет увеличить продукцию антибиотика в 2 раза. Предположительно, основную роль в этом играет нитрат-ион.

         На Рисунке 7 показано, что повышению продукции феназин-1-карбоновой кислоты больше всего способствует также присутствие в среде NH₄NO₃. В данном случае, предположительно, основным кофактором является ион аммония. Наименьшее влияние на биосинтез феназин-1-карбновой кислоты оказывают Co(NO₃)₂ и ZnSO₄·7H₂O.

Выводы

1. В ходе работы был выделен и идентифицирован комплекс антибиотиков феназинового ряда бактерии P. aeruginosa, штамм 67. Было установлено, что наиболее эффективным методом выделения феназинов является двукратная экстракция. На основе спектральных данных и температур плавления были установлено, что данный комплекс представлен феназин-1-карбоновой кислотой и 2-гидроксифеназином.

2. Была определена зависимость качественного и количественного состава феназинов от времени культивирования и состава питательной среды.  Выявили, что после трех дней культивирования в культуральной жидкости синегнойной палочки находится только феназин-1-карбоновая кислота, которая является предшественником производных феназина. На 3-4-й дни культивирования часть РСА превращается в 2-гидроксифеназин, но при этом продолжается продукция РСА. На 7-й день культивирования активность продуцента незначительна. Оптимальным временем культирования приняли 5 суток на среде Кинг В.

3. В работе было изучено    влияние различных минеральных солей на продукцию антибиотиков феназинового ряда от культуры синегнойной палочки, выявлены ингибиторы и кофакторы биосинтеза феназинов. Так, ионы меди и цинка являются ингибиторами биосинтеза 2-гидроксифеназина.  Установлено, что присутствие в среде соли NH₄NO₃ способствует продукции феназин-1-карбоновой кислоты и 2-гидроксифеназина.