Научные публикации (журналы ВАК)

Представлені основні фізико-хімічні особливості ДНК ірідовірусу зяберного некрозу коропа. Установлено, що вірус містить у собі дволанцюгову ДНК із константою седиментації S та температурою плавлення 84, 2 С. Плавка щільність ДНК складає 1, 6939 г/см, вміст Г-Ц пар, розрахований за величиною температури плавлення становить 36, 3 моль %, а за плавкою щільністю - 34, 6 моль %. Ендонуклеаза НМПІ розщеплювала ДНК вірусу на 21 фрагмент, Ват НІ—на 5, а Есо КІ—на 19 фрагментів. У складі вірусних білків виявлена РНК-полімеразна активність.

Ірідовірус зяберного некрозу коропа вивчений недостатньо, особливо це стосується його ДНК. В опублікованих нами раніше роботах (Яременко та ін., 19 Яременко, Бучацький 19 ) були представлені дані про основні біологічні властивості цього вірусу та описані методи його культивуванняВ даній роботі представлені основні фізико-хімічні особливості ДНК ірідовірусу зяберного некрозу коропа, вивчення яких є необхідною умовою для правильної таксономічної характеристики маловивчених вірусів. Матеріали та методи. Накопичення вірусу. В роботі використовували штам 4БЖ ірідовірусу зяберного некрозу коропа, отриманий від І. С. Щелкунова (Росія). Вірус накопичували в перевивних культурах клітин ЕРС та РНМ, а також на личинках великої вощинної молі (Яременко та ін., 1987).Очистка вірусу. Очистку вірусу в градієнті щільності цукрози проводили на ультрацентрифузі марки Бекман (Бучацький та ін., 1982).Ізоляція ДНК. ДНК виділяли фенольно-детергентним методом (Мармур, 1961). Концентрацію ДНК визначали за методом Спіріна (1958), ступінь дволанцюговості отриманої ДНК визначали по спектрам поглинання її розчинів в реакції з формальдегідом (Губарєв та ін.,1964).Визначення вмісту ГЦ пар. Уміст ГЦ пар в ДНК визначали шляхом рівноважного центрифугування в градієнті розчинів хлористого цезію в аналітичній центрифузі "МОМ-31706" (Мандель та ін., 1970), а також за температурами термічної денатурації. З цією метою ДНК розчиняли в стандартному цитратному розчині (0,15 М NaС1 +0,05V СНзСООH) із рН 7,0 у концентрації 20 мкг/мл і інкубували в інтервалі температур від 25°С до 100°С в кварцових кюветах із постійним температурним моніторингом. Контроль температури в кюветах реєстрували за допомогою термопари мідь-константан. Оптичну густину розчину ДНК вимірювали на спектрофотометрі "ІМсат 8Р - 800" при довжині хвилі 260 нм. Величину гіперхромного ефекту визначали за формулою: Н = (А/Аго)"1 х 100%, де Ат - оптична густина при температурі Т, а А2о - оптична густина при температурі 20°С. Температуру плавлення (Тпл) визначали як температуру, при якій досягалось 50% загального гіперхромізму.Визначення нуклеотидного складу за величинами Тпл проводили за допомогою загальноприйнятих методів (Мармур, Доті, 1962).Молекулярна маса.. Визначення молекулярної маси вірусної ДНК проводили за швидкістю її ренатурації у розчині 1 х 88С. Вимірювання проводили на спектрофотометрі "Шісат 8Р - 800" при довжині хвилі 260 нм. Після повної теплової дисоціації ДНК її реасоціацію виконували нижче Тпл). За контроль слугували препарати ДНК Е. соlі К12. Фрагментування вірусних ДНК проводили в ультразвуковому дезінтеграторі М8Е при частоті 20 кГц, амплітуді 20 мкм і максимальній потужності на протязі 15 хв. (з паузами по 30 сек.). Пробірки з розчином ДНК охолоджували в суміші лід-кухонна сіль (7атез еі аіі.,1968). Розрахунок молекулярної маси вірусної ДНК проводили на основі отриманих графіків швидкості ренатурації (Пріма, 1980).Константа седиментації. Визначення константи седиментації вірусної ДНК проводили в аналітичній центрифузі "МОМ 31706" при концентраціях 20, 40, 60, 80 мкг/мл. Розрахунок молекулярної маси ДНК проводили на основі визначеної константи седиментації (Пріма, 1980).Розмір геному. Визначення розміру геному вірусу проводили за методом рестрикційного аналізу з використанням таких ферментів рестрикції, як Ват НІ, Ніпсі III, Есо РЛ. Величину та кількість рестриктів визначали після обробки ДНК відповідними ферментами на протязі 90 хв. при температурі 37° С та електрофорезу в гелі агарози (Девіс та ін.,1984). В якості контролю використовували ДНК фагу X після обробки рестриктазою Ніпсі III.Наявність метильованих основ. Визначення аномальних (метильованих) основ проводили шляхом обробки вірусної ДНК рестриктазами М8Р-І та НРАП і електрофорезу отриманих при цьому фрагментів в гелі агарози.Гібридизація вірусних ДНК. Кількісне визначення гібридізації ДНК проводили шляхом визначення швидкостей їх ренатурації (Бе Ьеу еі аіі.,1970).Наявність ДНК- та РНК-полімераз. Визначення наявності в очищених віріонах ДНК- та РНК-полімераз проводили за стандартними методиками (8е<і\¥Іск еі аіі.,1972). Радіоактивність визначали в сцинтиляційній камері. Результати і обговорення В лінійному градієнті щільності цукрози (10-40%) смуга, в якій знаходився інфекційний вірус зяберного некрозу коропа, була розташована в зоні цукрози з щільність 32,5 %. Дефектний ірідовірус коропа розміщувався в зоні з 25 % -ною цукрозою. Очищений ірідовірус мав характерний синьо-блакитний колір з райдужним відтінком, який притаманний багатьом ірідовірусам, особливо ірідовірусам безхребетних. При очищенні ірідовірусу було установлено, що велика його кількість залишається зв'язаною з мембранами клітин, тому для руйнування цих зв'язків і успішної очистки вірусу кілька разів проводили заморожування та відтаювання вірусовмісного матеріалу.В ході досліджень було установлено, що плавка щільність ДНК ірідовірусу зяберного некрозу коропів в розчині хлористого цезію складає 1,6939 г/см3. Процентний вміст ГЦ-пар в ДНК вірусу, розрахований за величиною плавкої щільності, складає 34,6 моль %. Вміст ГЦ-пар, розрахований за величиною температури плавлення ДНК в стандартному сольовому розчині (84,2°С) складає 36,3 моль %.Всі препарати ДНК ірідовірусу коропа мали характерний спектр поглинання в ультрафіолетовій частині спектру з максимумом поглинання при260 нм і мінімумом при 232нм. Відношення Е2бо/Ег8о і Е260/Е230 складали 1,95-2,2, що свідчить про відсутність в препаратах домішок білків та вуглеводнів. Основні фізико-хімічні характеристики ДНК ірідовірусу зяберного некрозу коропа представлені в табл.Л. За контроль в цих експериментах слугувала ДНК ірідовірусу кровосисних комарів Аесіез рипсіог.При інкубації ДНК ірідовірусу зяберного некрозу коропа з 1,8% - ним розчином формальдегіду спектри поглинання ультрафіолетових променів не змінювались, що свідчить про дволанцюговість та нативність препаратів ДНК. 

Таблиця 1

Основні фізико-хімічні характеристики ДНК ірідовірусу зяберного некрозу коропа

Вторинну структуру препаратів ДНК оцінювали по характеру її плавлення в розчині 1 х 88С. Графіки плавлення препаратів ірідовірусних ДНК також свідчили про збереження вторинної структури ДНК ( рисі). Структурні переходи відбувалися у вузькому температурному діапазоні (4-6° С); гіперхромний ефект спостерігався при 38,9-39,9° С. Це свідчить про те, що вірусна ДНК відноситься до А-Т типу і має нативну подвійну спіраль.

Відомо, що вміст Г-Ц пар, розрахований за величинами плавкої щільності та Тпл добре співпадає у тих випадках, коли до складу ДНК входять лише так звані канонічні азотисті основи. Причиною незначного неспівпадання величин процентного вмісту ГЦ-пар в ДНК може бути як погрішність методів, так і наявність у ДНК вірусу мінорних нуклеотидів.

За даними, отриманими при вивченні кінетики реасоціації (Рис.2), установлено, що молекулярна маса ДНК ірідовіруса зяберного некрозу коропа складає 2,865 х 107 дальтон. Якщо враховувати наявність колапсного гіперхромізму, то за існуючими формулами (Вгіп.еп еі аіі.,1974) можна підрахувати, що вірусна ДНК має 14 % послідовностей, що повторюються. Дані по електрофорезу в гелі агарози свідчать про те, що рестриктаза Ніпсі III розщеплює вірусну ДНК на 21 фрагмент, рестриктаза Ват НІ на 5, а рестриктаза Есо КІ - на 19 фрагментів. Молекулярні маси цих фрагментів указані в табл.2.

v\:* {behavior:url(#default#VML);} o\:* {behavior:url(#default#VML);} w\:* {behavior:url(#default#VML);} .shape {behavior:url(#default#VML);} Normal 0 false false false MicrosoftInternetExplorer4 /* Style Definitions */ table.MsoNormalTable {mso-style-name:"Обычная таблица"; mso-tstyle-rowband-size:0; mso-tstyle-colband-size:0; mso-style-noshow:yes; mso-style-parent:""; mso-padding-alt:0cm 5.4pt 0cm 5.4pt; mso-para-margin:0cm; mso-para-margin-bottom:.0001pt; mso-pagination:widow-orphan; font-size:10.0pt; font-family:"Times New Roman"; mso-ansi-language:#0400; mso-fareast-language:#0400; mso-bidi-language:#0400;}

Таблиця 2

Молекулярні маси фрагментів ДНК ірідовірусу зяберного некрозу коропа, отримані під впливом ферментів рестрикції

При визначенні молекулярної маси ірідовірусу зяберного некрозу коропа за даними величини її константи седиментації ($20,* = 14,3 ) в 188С отримано значення 0,3 хЮ7 дальтон.

Дослідами по гібридизації ДНК ірідовірусу коропа з ДНК ірідовірусу комара Аесіез ршісіог установлено, що між цим ДНК існує 33% гомологічних послідовностей (Рис.З).

v\:* {behavior:url(#default#VML);} o\:* {behavior:url(#default#VML);} w\:* {behavior:url(#default#VML);} .shape {behavior:url(#default#VML);} Normal 0 false false false MicrosoftInternetExplorer4 /* Style Definitions */ table.MsoNormalTable {mso-style-name:"Обычная таблица"; mso-tstyle-rowband-size:0; mso-tstyle-colband-size:0; mso-style-noshow:yes; mso-style-parent:""; mso-padding-alt:0cm 5.4pt 0cm 5.4pt; mso-para-margin:0cm; mso-para-margin-bottom:.0001pt; mso-pagination:widow-orphan; font-size:10.0pt; font-family:"Times New Roman"; mso-ansi-language:#0400; mso-fareast-language:#0400; mso-bidi-language:#0400;} v\:* {behavior:url(#default#VML);} o\:* {behavior:url(#default#VML);} w\:* {behavior:url(#default#VML);} .shape {behavior:url(#default#VML);} Normal 0 false false false MicrosoftInternetExplorer4 /* Style Definitions */ table.MsoNormalTable {mso-style-name:"Обычная таблица"; mso-tstyle-rowband-size:0; mso-tstyle-colband-size:0; mso-style-noshow:yes; mso-style-parent:""; mso-padding-alt:0cm 5.4pt 0cm 5.4pt; mso-para-margin:0cm; mso-para-margin-bottom:.0001pt; mso-pagination:widow-orphan; font-size:10.0pt; font-family:"Times New Roman"; mso-ansi-language:#0400; mso-fareast-language:#0400; mso-bidi-language:#0400;}

Рис.З     Гібридизація  геномів  ірідовірусу  зяберного  некрозу  коропа та ірідовірусу комара Аесіез ршісіог.

В останні роки дослідниками із різних країн було показано, що до складу геномів ірідовірусів входить велика кількість мінорних азотистих основ. Наприклад, в геномі ірідовірусу лімфоцистозу риб міститься 22% 5- метилцитозина (                          ). Висока ступінь метилування цитозину в

п'ятому положенні характерна для ДНК усіх ірідовірусів хребетних

При проведенні рестрикційного аналізу ДНК ірідовірусу зяберного некрозу коропа з використання рестриктаз М8Р-1 та НРА Л було установлено, що в геномі цього вірусу метилцитозин відсутній. Проте, це не виключає можливої наявності в ньому метилгуаніну.

При перевірці наявності в складі вірусних білків ірідовірусу коропа ДНК-та РНК-полімераз установлена присутність в них РНК-полімеразної активності. Кількість радіоактивного уридінтрифосфату в досліді з вірусом сягала 1620 імп/хв., тоді як в контролі кількість імпульсів за одну хвилину не перевищувала 20.

Таким чином, отримані результати свідчать про належність ірідовірусу зяберного некрозу коропа до родини Ігісюуігісіае. Великі розміри вірусу та наявність у його ДНК значного ступеню гомологічних послідовностей з геномом ірідовірусу комарів вказують на можливу приналежність ірідовірусу коропа до роду СЬІогігісюуішз. Проте, для остаточного вирішення його таксономічного положення необхідно вивчити послідовність нуклеотидів в геномі цього вірусу.

Роль ірідовірусів в інфекційній патології риб зростає з кожним роком. Крім добре вивченого вірусу лімфоцистозу риб (12), в останній час з природних популяцій риб були ізольовані такі ірідовіруси, як вірус некрозу еритроцитів (15), вірус епізоотичного гемопоетичного некрозу (13), ірідовірус звичайного сома та котячого сомика (8), морського ляща (16), російського осетра (7), вугрів (10), групера (11).

Список л1тератури

1.Попкова Г.И., Щелкунов И.С. Выделение вируса от карпов, больных жаберным некрозом. Рыбное хозяйство, 1978, №4, с.34-38 2. Яременко Д.М., Бучацкий Л.П., Бойко А.Л. Биологические свойства вируса - возбудителя жаберного некроза карпа.

3.         . Яременко Д.М., Бучацкий Л.П., Бойко А.Л. Размножение иридовируса карпа в культурах клеток рыб и личинках большой вощинной моли Тез.докл.научно-практ.совещ.Киев, 1987, с.27

4.         Бучацкий Л.П., Кузнецова М.А., Шербан С.Д. Очистка иридовируса комаров в градиенте плотности сахарозы. Микробиол.журнал, 1982, №6, с.77 - 79.

5.         Marmur J. A procedure for the isolation of DNA from microorganisms. J.MoLBiol., 1961,3,N1, p.208-218.

6.         Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот. Биохимия, 1958, 23, №5, с.656-662.

7.         Губарев Е.М., Поверенный А.М.,Алейникова Т.Я. Использование реакции с формальдегидом для характеристики некоторых физико- химических свойств нуклеиновых кислот. Биофизика, 1964, №4, с.434-440.

8.         Мандель М., Шильдкраут К., Мармур Дж. Определение содержания гуанина и цитозина в ДНК с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия.В кн.: Методы исследования нуклеиновых кислот./Под ред.А.Н.Белозерского Москва, Мир, 1970, с. 175- 183.

9.MarmurJ, Doty P. Determination of the base composition of deoxyribonucleic acid from its thermal denaturation temperature.J.Mol.Biol., 1962,N5, p.l 109-1112.

10         Wetmur J.,Davidson N. Kinetics of renaturation of DNA. J.Mol.Biol. 1968,31, p.349-370.

11  Прима В.И. Анализ реассоциации фракций ДНК. Биохимия, 1980, т.45, вып.З, с498-506.

12            Девис Р., Ботстайн Д., Ройт Д. Методы генетической инженерии В кн.:Генетика бактерий.Москва,Мир, 1984, с. 108-155.

13  DeLey J.,Cattoir H.,Reynaerts A. The quantitative measurement

14 Sedwick W. D., Wang T. S., Korn D. Purification and properties of nuclear cytoplasmic deoxyribonucleic acid polymerases from human KB cells. J. Biol. Chem. 1972, v. 247, p. 5026-5033

Авторы:

Яременко Д. М., інженер

Бучацький Л. П., доктор біол. наук, академік УЗАН Інститут рибного господарства УААН