Научные публикации (журналы ВАК)

Изучено влияние хронической интоксикации ионами свинца (0,5 мг/дм3) на ионный состав крови, показатели окислительно-антиоксидантной системы, и резистентность мембран эритроцитов сеголеток карпа. Получены данные, свидетельствующие о развитии окислительного стресса в организме гидробионтов, что важно для оценки состояния их здоровья и мониторинга рыбохозяйственных водоемов. Ключевые слова: кровь, карп, стресс, тяжелые металлы. 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

 

При решении проблем сохранения и восстановления запасов промысловых рыб в естественной среде обитания важное место отводится разработке современных методов диагностики состояния водных биоресурсов. Актуальность таких исследований в значительной степени определяется ростом антропогенной нагрузки на природные водоемы, где рыбы, как конечное звено трофической цепи, подвергаются серьезной токсикологической угрозе. Стресс и вызываемые им повреждения и заболевания у рыб являются практически постоянной составляющей интенсивного рыбоводного хозяйства. Не вызывает сомнения необходимость оценки состояния рыб в лабораториях на основе диагностических исследований (Будников, 1998; Мелехова, 2007).

Известно, что тяжелые металлы, являются одними из самых опасных ксенобиотиков, которые могут нарушать структурную целостность мембран, приводящую к их деформациям, лизису клетки и её гибели. Под их воздействием разрушаются мембраны эритроцитов и развивается гемолиз. Кроме того, известно, что многие белки активируются или ингибируются в зависимости от распределения ионов кальция в клетке, и поэтому тяжелые металлы могут вступать в конкурентные связи с кальцием и по-разному влиять на функции клетки.

В связи с этим представляется актуальным диагностика мембран при хроническом загрязнении водной среды тяжелыми металлами и развитием стресса.

Целью данной работы явилось исследование хронического влияния ацетата свинца на ионный состав сыворотки крови, показатели окислительно-антиоксидантной системы, и резистентность мембран эритроцитов сеголеток карпа.

 

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

 

Объектом исследования служили сеголетки обоего пола карпа (Cyprinus carpio L., 1758 г) (5–6 месяцев, массой 100–150 г). Рыбы были отловлены из прудов Широкольского рыбоводного комбината Дагестана в ноябре 2009 года перед их переброской в зимовальные водоемы.

Эксперименты проводили в аквариумах объемом 250 л. В каждом аквариуме содержались по 15–20 рыб, в которых создавались условия постоянного температурного (19–23°С) и газового режима. Кормили рыб живым трубочником Tubifex tubifex.

В хронических лабораторных опытах был испытан ацетат свинца с содержанием в водной среде 0,5 мг/дм3 (ПДК – 0,1 мг/дм3) (Волошина, 2006).

На 5, 15, 30 и 40 дни эксперимента кровь подопытных и контрольных рыб подвергали анализам. Кровь брали прокалыванием из хвостовой вены. В сыворотке крови исследовали содержание ионов калия, натрия и кальция, кислотную резистентность эритроцитов (Леонова, 1987), содержание малонового диальдегида (МДА) (Андреева и др., 1988), каталазную (Королюк и др., 1988) и общую антиоксидантную активности (ОАА) (Демчук и др., 1990).

Статистическую обработку результатов проводили методом малой выборки по t-критерию Стьюдента (Калинина, 2002).

 

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

 

Результаты исследований представлены в таблице и на рисунках 1-3.

По нашим данным на 5 день содержания рыб в среде с ионами свинца отмечается повышение содержания ионов натрия (на 12.3%) и снижение концентраций ионов калия (на 39.5%) и кальция (на 30.8%).

В последующем, на 15, 30 и 40 дни содержание ионов натрия и кальция возвращается к норме и лишь незначительно уменьшается относительно контрольных значений. Однако, содержание ионов калия в сыворотке крови значительно ниже контроля на 15, 30 и 40 дни на 42.1; 47.4 и 42.1% соответственно по сравнению с контролем.

Изменения концентрации калия, натрия и кальция в крови приводит к  нарушению соотношения между этими катионами. По нашим данным (табл.; рис. 2) видно, что уже на 5 день воздействия ацетатом свинца отмечается значительное увеличение соотношения Na+/K+ (63.5), которое остается повышенным на протяжении всего эксперимента. Относительно соотношения Na+/Ca2+ можно заметить, что оно повышается на 5 день до 81 и в дальнейшем снижается до 48 на 30 и 40 дни. Изменение указанных соотношений свидетельствует о влиянии ионов свинца на работу Na+/K+ - насоса, поддерживающего постоянство ионных градиентов, и системы Na+/Ca2+ - обмена, обеспечивающего сопряженный разнонаправленный трансмембранный перенос ионов натрия и кальция.

Известна способность свинца связываться с белками плазмы крови и тканей и инициировать процессы перекисного окисления липидов и белков. В наших исследованиях показано повышение концентрации МДА в крови, а также активация систем антиоксидантной защиты при хроническом содержании рыб в среде с ионами свинца.

Так, содержание МДА в этих условиях повышается на 5, 15, 30 и 40 дни интоксикации на 73.3; 19.3; 46.7 и 40.0% соответственно по сравнению с контролем.

Повышение содержания МДА в сыворотке крови сеголеток карпа сопровождалось коррелятивным повышением каталазной и общей антиоксидантной активности. Максимальное повышение активности каталазы (на 24,2%) отмечается на 5 день опыта. На остальных этапах экспозиции рыб в среде с ацетатом свинца активность фермента находится в пределах нормы. Общая антиоксидантная активность остается повышенной в течение всего периода эксперимента.

О разрушении эритроцитарных мембран в результате действия ионов свинца свидетельствует снижение резистентности мембран эритроцитов к действию гемолитика.

На рисунке 3 отражены эритрограммы кислотной резистентности в норме и при действии ацетата свинца.

Эритрограмма контрольных рыб имеет одну вершину с максимумом на 1.5 мин. В этой точке гемолизирует 30.7% эритроцитов. Продолжительность гемолиза составляет 6.5 мин. Размах основания пика – 2.5 мин. В крови у контрольных рыб наиболее многочисленной является среднестойкая популяция эритроцитов (58.8%). На долю низко- и высокостойких эритроцитов приходится 0.2 и 37.8% соответственно.

Пребывание рыб в среде с ионами свинца в течение 5 суток привело к сдвигу эритрограммы влево к 1 мин и повышению доли эритроцитов, подвергшихся гемолизу на пике эритрограммы, до 51.9%. Эритрограмма имеет небольшой дополнительный пик  на 2.5 мин. Продолжительность кислотного гемолиза и размах основания пика сокращены до 5.5 мин и 1.5 мин соответственно.  В этот период отмечается преобладание низкостойких (51.9%) эритроцитов. Доля высоко- и среднестойких эритроцитов снижается до 19.6 и 28.4% эритроцитов соответственно.

Кислотная эритрограмма сеголеток карпа, подвергшихся воздействию ионов свинца в течение 15, 30 и 40 суток существенно не отличается от эритрограммы, полученной на 5 день эксперимента. Различия отмечаются лишь в количестве гемолизированных эритроцитов на пике эритрограммы (1 мин). Так, на 15 и 30 дни оно составляет 96.0%, на 40 день – 42.0%. На этих этапах также отмечается преобладание низкостойких эритроцитов.

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

 

По характеру изменений в ионном составе крови сеголеток карпа отмечаются концентрационные отличия между изученными ионами в зависимости от длительности интоксикации. Так, содержание ионов натрия и кальция наиболее подвержено изменениям на начальном этапе интоксикации (5 день): снижается содержание кальция и повышается концентрация натрия. В этот период организм, видимо, активно использует компенсаторные механизмы для восстановления гомеостаза. Причем, степень возвращения уровней изученных показателей к исходному практически одинаков. Для ионов же калия снижение концентрации отмечено в течение всего эксперимента. Стойкое увеличение концентрации ионов калия в течение всего периода наблюдения свидетельствует о адаптации рыб к интоксикации.

Подобного рода изменения в содержании электролитов связано, вероятно, с повреждением мембранных структур, что может быть обусловлено как непосредственным действием металла на мембраны клеток, так и стрессовой реакцией организма, обусловленной хроническим действием ацетата свинца.

Есть сведения о том, что при стрессе в крови происходит снижение уровня натрия и увеличение уровня калия разной интенсивности в зависимости от степени адаптированности животных (Мухля, Орлов, 1990). Известно также, что при повреждении клетка теряет натрий и накапливает калий, что приводит к увеличению содержания воды в ней, набуханию и отеку (Желтова, 2005). Наши исследования выявили противоположную направленность изменений в содержании этих катионов в сыворотке крови сеголеток карпа. Вероятно, динамика содержания калия при стрессе зависит от исходного уровня его в крови (Мартемьянов и др., 2003). В исследованиях автора на рыбах показано, что концентрация калия при стрессе понижается, если объекты перед началом эксперимента уже находились в состоянии стресса. Соответственно, в крови животных уже наблюдалась гиперкалиемия и были включены системы, работа которых направлена на снижение концентрации калия в крови. Добавочное воздействие на фоне включенных защитных систем практически не оказывает дополнительного влияния в сторону увеличения содержания калия в сыворотке крови. Наоборот, концентрация его продолжает снижаться, стремясь к низкому оптимальному уровню.

Нарушение концентрации ионов натрия, калия, кальция может быть причиной существенных расстройств различных систем и органов, так как они необходимы для обеспечения нормального уровня обменных процессов и поддержания ферментного статуса. Очевидно, существует зона концентрации электролитов в околоклеточной и внутриклеточной среде, в которой возможна регуляция физиологических функций без дополнительной адаптации, но дальнейшее изменение концентрации ионов может привести к нарушениям функций организма, прежде всего клеточных мембран.

Токсический эффект воздействия металлов обычно обусловлен их взаимодействием с клеточной мембраной. Эффект свинца может быть связан с двумя главными механизмами действия. Значительная аффинность к сульфгидрильным группам белков и формирование ковалентных связей с этими группами металлы могут ингибировать активность ферментов или нарушать целостность клеточных мембран. Другой механизм проявления токсичности металла – конкуренция и замещение эссенциальных катионов (Калетин, 2006).

В результате влияния ионов свинца возникает избирательная инактивация сульфгидрильных, карбоксильных групп, образуются ионные каналы в мембране, что приводит к нарушению проницаемости клеточной мембраны, нарушению электролитного состава клетки, метаболизма, нарушению специфических функций, что особенно важно для выполняющих проводящую и сократительную функцию тканей.

Связь транспорта ионов и окислительного обмена не подвергается сомнению. Об этом свидетельствуют отмеченные нами изменения, возникающие в системе про- и антиоксидантной защиты при хроническом действии ионов свинца. Повышение содержания МДА – конечного продукта ПОЛ – усиление общей антиоксидантной активности на фоне относительной стабильности активности каталазы могут свидетельствовать о напряжении окислительно-антиоксидантной системы в условиях хронического действия ацетата свинца.

Известно, что стрессовые воздействия у животных вызывают усиление неферментативного пути свободнорадикального окисления липидов в организме, в результате чего в различных органах и тканях накапливаются токсические продукты, обладающие гемолитической активностью. Эти состояния повреждают структуры клеточных мембран, в том числе транспортные системы, в результате чего увеличивается проницаемость и ингибируется активный перенос веществ (Меерсон и др., 1981).

Полученные результаты свидетельствуют о значительных качественных изменениях состава эритроцитарной популяции сеголеток карпа, подвергшихся хроническому воздействию ацетатом свинца. Преобладание в популяции эритроцитов с низкой кислотной резистентностью указывает на значительное ее постарение, которое может быть связано с деструктивными процессами, развивающимися в эритроцитарных мембранах в условиях хронического воздействия токсиканта.

Таким образом, на основании полученных нами данных можно сделать заключение о возможности развития деструктивных процессов в клеточных мембранах в результате хронического действия ацетата свинца. О достоверности данного утверждения свидетельствуют изменение ионного состава крови, снижение резистентности эритроцитов к действию гемолитика, а также активация процессов перекисного окисления липидов и угнетение систем антиоксидантной защиты крови сеголеток карпа.

Изменение концентрации ионов натрия, калия и кальция, а также состояния окислительно-антиоксидантной системы и мембран эритроцитов можно рассматривать в качестве маркеров развития стрессовой реакции клеток на действие чужеродных факторов среды.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

 

При 40-дневном содержании сеголеток карпа в среде с ионами свинца наиболее значительные изменения в ионном составе крови выражаются в повышении концентрации ионов Na+ (на 12.3%), снижении содержания ионов K+ и Ca2+ (на 39.5 и 30.8%) на 5 день; снижении содержания ионов K+ (на 42.1; 47.4 и 42.1%) на 15, 30 и 40 сутки соответственно по сравнению с контролем. При хронической интоксикации водной среды ацетатом свинца в течение 40 суток  наблюдается активация процессов ПОЛ, о чем свидетельствует повышение содержания МДА в сыворотке крови (значительнее всего на 5 день – на 73.3%), повышение каталазной и общей антиоксидантной активностей (на 24.4 и 58.0% соответственно по сравнению с контролем) на 5 день. Длительное пребывание рыб в среде с ацетатом свинца привело к деструктивным изменениям в эритроцитарных мембранах, выражающихся в левом сдвиге эритрограммы (к 1 мин), сокращении ее продолжительности (до 5.5 мин), преобладании низкостойких эритроцитов (51.9%). Кислотные эритрограммы, полученные на остальных этапах эксперимента не имеют существенных отличий от контроля.

 

ЛИТЕРАТУРА

 

1.     Андреева Л.И., Кожемякин А.А., Кишкун А.А. Модификация метода опре­деления перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой // Лаб. дело. 1988. № 11. С. 41–43.

2.     Будников Г.К. Тяжелые металлы в экологическом мониторинге водных систем // Сорос. образ. журн. Биология. 1998. Т.7. №5. С. 23–29.

3.     Волошина Г.В. Экологическая оценка состояния поверхностных вод реки Понура // Эколог. вест. Север. Кавказа. 2006. Т.2. № 1. С. 118–122.

4.     Демчук М.Л., Левченко Л.И., Промыслов М.Ш. Процессы перекисного окисления липидов при черепно-мозговой травме // Нейрохимия, 1990. Т.9. №1. С. 108–110.

5.     Желтова Н.А. Патологическая физиология. М.: Владос-Пресс, 2005. 214 с.

6.     Калетин Г.И. Влияние дисбаланса микроэлементов на регуляцию апоптоза // Вестник ОГУ. 2006. №12. С. 11–113.

7.     Калинина В.Н., Панкин В.Ф. Математическая статистика. М.: Дрофа, 2002. 336 с.

8.     Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. М.: МЕДпресс-информ, 2004. 910 c.

9.     Королюк М.А., Иванова Л.К., Майорова И.Г., Токарева В.А. Метод опре­деления активности каталазы // Лаб. дело. 1988. № 4. С. 44–47.

10.                        Леонова В. Г. Анализ эритроцитарных популяций в онтогенезе человека. – Новосибирск: Наука, 1987. –  С. 241.

11.                        Мартемьянов В.И. Динамика содержания катионов в плазме крови, эритроцитах и мышечной ткани плотвы в период размножения // Биология внутренних вод. 2003. №3. С. 20–123.

12.                        Меерсон Ф.З., Архищенко Ю.В., Рожицкая И.И., Коган В.Е. Повреждение кальций-транспортирующей системы саркоплазматического ретикулума сердца при эмоционально-болевом стрессе // Бюл. экспер. биол. и мед. 1981. №4. С. 405–406.

13.                        Мухла А.М., Орлов М.М. Соотношение ионов натрия, калия и гормонов коры надпочечников в крови у морских млекопитающих на разных этапах адаптации к пребыванию в неволе // Тез. докл. Всесс. совещ. по изуч., охране и рац. исп. морских млекопитающих. М. 1990. С. 202–203.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

THE INFLUENCE OF THE IONS OF LEAD ON DYNAMICS OF SOME INDICATORS OF THE BLOOD, AS MARKERS OF STRESS REACTION

B. S. Musaev, M. M. Gabibov, A. I. Rabadanova, G. R. Muradova

Dagestan state University, 367001 Makhachkala, Gadzhieva Str. 43 а, Russia

Е-mail: ashty06@mail.ru

Has arrived in edition of 25.07.2010 year.

 

The influence of the chronic intoxication by lead ions (0,5 mg/dm3) on ionic structure of the blood, indicators oxidative-antioxidant systems, and resistance of the membranes of  erythrocytes of carps are studied.

The data, being indicative of development the oxidative stress in hydrobiontes are important for estimation of they health and monitoring water environment.

        

Key words: blood, carp, stress, heavy metals.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Таблица. Влияние длительного воздействия Pb2+ на содержание Na+, K+ и Ca2+ в сыворотке крови сеголеток карпа

показатели дни экспозиции	Na+, мкмоль/л	K+, мкмоль/л	Ca2+, мкмоль/л	Na+/K+	Na+/ Ca2+
контроль	130.0±14.5	3.8±1.1	2.6±0.8	34.2	60.0
5	146.0±19.1*	2.3±0.9*	1.8±0.5*	63.5	81.0
15	129.2±6.9	2.2±0.6*	2.5±1.2	58.6	52.0
30	125.5±10.4*	1.9±0.5*	2.6±1.1	63.0	48.0
40	126.0±15.2*	2.2±0.7*	2.6±1.3	57.2	48.0

 

* – достоверность относительно контроля.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 1. Динамика содержания Na+, K+ и  Ca2+ в сыворотке крови сеголеток карпа при хроническом воздействии ионов свинца.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 2. Динамика изменений показателей окислительно-антиоксидантной системы сыворотки крови сеголеток карпа при интоксикации водной среды ацетатом свинца в зависимости от длительности эксперимента (в % по отношению к контролю): МДА – малоновый диальдегид, КА – активность каталазы, ОАА – общая антиоксидантная активность.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 3. Изменение кислотной устойчивости эритроцитов крови сеголеток карпа в зависимости от длительности интоксикации водной среды ацетатом свинца.